FRM1基因突变检测试剂盒

人类SMN1/DMD/FRM1基因突变检测试剂盒

        假肥大性肌营养不良症（DMD）是最常见的X连锁隐性遗传的肌病，发病率为1/3500活产男婴，无明显地理或种族差异，患儿多呈明显家族性，另有1/3由新发突变而致病。DMD基因的突变是导致假肥大性肌营养不良症的主要病因，最常见的类型是缺失型，约占55%~65%，以第44-45号、第2-19号外显子间最为多见；基因重复占5%~15%；点突变占30%左右。
        脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy，SMA）是一种源于脊髓前角退变引起肌无力和肌萎缩的神经系统遗传性疾病，属于常染色体隐性遗传病。活产婴儿的发病率为1/6000~1/10000，人群携带者频率为1/40~1/50，居儿童致死性常染色体遗传病的第2位。运动神经元存活基因1（SMN1）的外显子纯合缺失（90%~95%）或SMN1缺失/点突变（或部分缺失）（3~5%）的复合杂合突变是导致该疾病发生的主要原因。运动神经元存活基因2（SMN2）基因会转录产生10~20%全长有功能的转录本，因此在SMA病人中，SMN2基因拷贝数与临床表型严重程度密切相关。
       脆性X综合征（fragile X syndrome，FXS）是最常见的X连锁隐性遗传的单基因性智力低下综合征，占所有X-连锁智力低下疾病的15%~25%，发病率仅低于21-三体综合征。超过99%的脆性X综合征患者是由FMR1基因三核苷酸重复序列（CGG）n扩增和超甲基化所致。全突变（n≥200）的患者多为男性，在男性人群中的发病率为1/6000~1/4000，女性的发病率约为1/8000。全突变的男性患者及部分女性患者将智力低下生活无法自理，终身无法治愈，给家庭和社会带来沉重负担。FMR1基因的前突变（n＝55~199）与女性卵巢储备功能下降、复发性流产、卵巢功能早衰、不孕不育、IVF失败有关，与男性成年后的震颤/共济失调有关。55xCGG重复是一个分水岭，小于55x个体表型通常正常，后代发生突变的可能性也很低，但大于55x是前突变/全突变携带者或患者，而且后代传递中有较高频率突变为全突变从而产生更为严重的临床症状。
        上述三种遗传病发病率高、致死/致残率高，几乎没有有效的治疗手段，但却是可以通过对备孕人群或已妊娠人群进行对应基因的突变筛查预防绝大部分患儿的出生。美国妇产科年会（ACOG）在“基因组医学时代下的携带者筛查”的专家共识中，脆性X综合征和脊髓性肌萎缩症是向所有备孕人群或已妊娠人群强烈推荐筛查的2种疾病。

        人类SMN1/DMD/FMR1基因突变检测试剂盒通过采集人基因组DNA，应用公司自主研发且具有自主知识产权的AccuCopy®多重荧光竞争性PCR（授权专利号：ZL201010180551.2，Du etal，2012）用于SMA（SMN1及SMN2）和DMD基因的拷贝数检测。应用特殊荧光CGG重复PCR技术来进行FXS的FMR1 CGG重复数的检测。该检测产品主要的展开领域为妇产科，作为SMA/DMD/FXS的携带者筛查对所有备孕期或孕早期的女性进行普筛，筛查出高危人群，及时进行产前诊断，有效避免严重遗传病患儿的出生。

        对于DMD，检测高频突变的34个外显子的拷贝数，预计能覆盖现有报导95%以上的拷贝数变异，若检测到阳性样本，可采用本公司“人类DMD基因突变检测试剂盒”验证，该试剂盒覆盖全部79个外显子，可进一步明确具体的缺失范围。此外，该三联检试剂盒中包含的20个点突变位点均为文献报道5次以上的热点突变，可进一步提高3~5%检出率。
        对于SMA，可检测SMN1及SMN2的拷贝数，部分外显子缺失重复突变以及10个高频点突变，其中含3个欧洲人群特有高频位点。此外，该试剂盒还可对g.27134T＞G进行分型，该SNP位点的G等位基因据报道与双SMN1基因连锁显著相关，检出该G等位基因的SMN1拷贝数为2的个体可能为2+0型高危个体，建议进行父母检测辅助分析排除。
对于FMR1，主要检测FMR1基因的CGG重复数，通过本项检测可判断是否存在大于或等于55x的重复突变。对于阳性样本，建议采用美国进口AmplideX试剂盒进行CGG具体重复数的确认。

        SMN1、SMN2和DMD基因的拷贝数检测采用的是公司自主研发且具有自主知识产权的AccuCopy®多重荧光竞争性PCR技术；SMN1和DMD的点突变检测则采用多重荧光ARMS法；FMR1 CGG 重复突变筛查采用特殊荧光CGG重复PCR法。

        通过取一定量的竞争性DNA片段混合物（每个竞争性DNA片段与各自对应基因片段通常仅有2-3bp差别），然后与合适量的检测样本DNA混合，随后利用多重荧光PCR引物对检测样本DNA及竞争性DNA片段混合物进行参照基因片段和目标基因片段的扩增；多重PCR产物经荧光毛细管电泳后根据扩增长度差异进行分离，获取不同基因片段的检测样本峰（S）以及竞争性DNA峰（C）的峰高值；分析每个基因片段的S/C峰高比值（称R值），然后将目标基因R值除以参照基因R值获得RR值(用于校正不同检测样本DNA用量差异)，通过将检测样本的RR值除以参照样本的RR值（用于校正不同基因片段对应竞争性DNA的用量差异）后再乘以参照样本在该目标基因上的拷贝数即可获得目标基因的精确拷贝数。